Eiwitsynthese: hoe de basenvolgorde in DNA bepaald kan worden
Een cel maakt eiwitten op basis van de basenvolgorde in het DNA. Voor het examen moet je kunnen beschrijven hoe je die volgorde zelf bepaalt.
DNA bestaat uit vier basen: adenine (A), thymine (T), cytosine (C) en guanine (G). De volgorde van deze basen bepaalt welke eiwitten een cel maakt. Om die volgorde te kennen, moet je de basen kunnen aflezen. Dat kan op verschillende manieren.
Sanger-sequencing
Bij de Sanger-methode maakt een DNA-polymerase een nieuwe streng langs een matrijsstreng. In het mengsel zitten ook ddNTP's. Een ddNTP heeft geen 3'-OH-groep. Daardoor stopt de verlenging op die plek. Elk type ddNTP heeft een eigen kleur, dus ontstaan er fragmenten van alle lengtes. Elk fragment eindigt op een bekende base.
Die fragmenten scheid je met gelelektroforese. Kortere fragmenten schuiven verder door de gel. Zo lees je de nieuwe streng af van het kortste naar het langste fragment. Die volgorde loopt van 5' naar 3'.
Next-generation sequencing
Bij next-generation sequencing (NGS) worden miljoenen DNA-fragmenten tegelijk gesequenced. Bij elke stap wordt één base ingebouwd, en elke base geeft een eigen lichtsignaal. Een computer zet die signalen om in een basenvolgorde. Per fragment levert dit korte stukjes op. Daarna past een computer die stukjes weer aan elkaar.
Onthoud
Een basenvolgorde bepaal je met Sanger-sequencing of met next-generation sequencing.
Bij Sanger-sequencing stoppen fragmenten bij een ddNTP, omdat er geen 3'-OH-groep is.
Gelelektroforese sorteert fragmenten op lengte, waarbij het kortste fragment het verst loopt.
Next-generation sequencing leest miljoenen fragmenten tegelijk en levert korte stukjes op.
De nieuwe streng leest 5' naar 3' en is complementair aan de matrijsstreng.
Voorbeeld uit een echt examen
none
Bepaal de basenvolgorde van de nieuwe streng uit een gel met vijf banden na Sanger-sequencing.
- 1
De gel toont van onder naar boven de basen A, C, G, T en T.
Veelgemaakte fouten
Leerlingen lezen de gel van boven naar beneden. Lees hem juist van onder naar boven, van het kortste naar het langste fragment.
Leerlingen zetten de basen van de matrijsstreng direct onder de nieuwe streng zonder te draaien. Let op dat de matrijsstreng van 3' naar 5' loopt.
Leerlingen denken dat ddNTP's de verlenging versnellen. Een ddNTP stopt de verlenging, omdat het geen 3'-OH-groep heeft.
Snel checken
Waarom stopt de verlenging van een DNA-streng bij de Sanger-methode op een ddNTP?
Bij gelelektroforese van Sanger-fragmenten wordt de nieuwe streng afgelezen. Welke uitspraak is juist?